Гэри Уэйд (перевод статьи)
Я искал схемы для сборки любого из пяти микроскопов, созданных доктором Роялом Р. Райфом. Принцип работы универсального микроскопа Райфа описан в статье «Новые микроскопы» Р. Э. Зайделя, доктора медицины, и М. Элизабет Винтер, опубликованной в февральском номере журнала Института Франклина за 1944 год. Эта же статья была опубликована в ежегодном отчёте директоров Смитсоновского института за 1944 год в Вашингтон, Округ Колумбия. К сожалению, описание неточно и неполно. Однако, внимательно изучив фотографии пяти построенных микроскопов Райфа и проведя различные расчёты для возможной реконструкции микроскопов Райфа, я смог создать работоспособную универсальную модель микроскопа Райфа. С помощью микроскопов Райфа можно наблюдать за живыми вирусами (см. рис. 7).
Чтобы понять, как увеличение и разрешающая способность микроскопа Райфа могут превосходить показатели обычного оптического микроскопа, необходимо разобраться в причинах ограничений увеличения и разрешающей способности обычного оптического микроскопа. На рисунке 1 показана простейшая форма микроскопа.
С точки зрения только геометрической оптики, объектив и окуляр на рисунке 1 можно заменить комбинациями линз, обеспечивающими неограниченное увеличение. Однако из-за явления дифракции, а именно дифракции Фраунгофера, и явления аберрации линз существует практический предел полезного увеличения. Теоретические исследования и эксперименты показали, что явление дифракции Фраунгофера обычно является основным ограничивающим фактором, определяющим разрешающую способность системы линз при формировании изображения. На рисунке 2 показана плосковыпуклая линза, перед которой находятся два объекта, О и О’.
Линза формирует изображения I и I’ соответственно. Изображения I и I’ сформированы на рисунке 2 с использованием только принципов геометрической оптики. Обратите внимание, что О и О’ обозначены маленькими чёрными точками. Кроме того, обратите внимание, что рисунок 2 представляет собой символическую диаграмму, поэтому белый фон можно заменить чёрным, а чёрные линии и кривые — любым другим цветом, например жёлтым. Символическая информация, содержащаяся на рисунке, останется прежней. Теперь пусть О и О’ будут источниками жёлтого света, I и I’ теперь будут жёлтыми точками. Пусть диаметр (размер) источников жёлтого света О и О’ становится всё меньше и меньше. Диаметр изображений I и I’ по законам геометрической оптики также будет становиться всё меньше и меньше. На самом деле, согласно принципам геометрической оптики, по мере того как диаметры О и О’ стремятся к нулю, стремятся к нулю и диаметры I и I’. Однако из-за явления дифракции Фраунгофера по мере того, как диаметры О и О’ стремятся к нулю, диаметры изображений I и I’ стремятся к конечному ненулевому размеру. На самом деле изображения I и I’ точечных (нулевого диаметра) источников света О и О’ представляют собой концентрические светлые и тёмные зоны, как показано на рисунке 3.
Интенсивность света, показанная на рисунке 3, наблюдается вдоль любой линии, проходящей через центр I (или I’) и под прямым углом к кратчайшему отрезку, соединяющему I (или I’) и О (или О’). Итак, вернёмся к рисунку 2 и увидим, что если расстояние S между двумя точечными (нулевого диаметра) источниками света O и O’ станет достаточно маленьким, их изображения I и I’ начнут накладываться друг на друга. Это означает, что любые два самосветящихся точечных источника света O и O’, расположенные на интересующем нас объекте (образце), нельзя наблюдать по отдельности, если только они не находятся достаточно далеко друг от друга, чтобы центральная яркая зона их дифракционных картин Фраунгофера не накладывалась заметно друг на друга. В оптике стандартное соотношение между s, w, n и i для линзы рис. 2 выглядит так:
S — минимальное расстояние между точками O и O’, на котором они различимы, W — длина волны используемого света, n — показатель преломления среды между точками O (или O’) и поверхностью линзы, i — угол, как показано на рисунке 2. Подставив соответствующие значения W, n и i в уравнение 1, для широко используемых мощных оптических микроскопов получим значение S около 2000 ангстрем или 0,2 микрона, что больше среднего радиуса вирусов. Однако этот предел разрешения в 0,2 микрона всё равно слишком оптимистичен, если учитывать другие эффекты искажения в системах линз. Минимальное разрешающее расстояние, определяемое уравнением (1), не содержит явного указания на диаметр (D) линзы. Однако при непосредственном рассмотрении рисунка 2 становится ясно, что i зависит от D. Теперь очевидно, что независимо от того, насколько сильно окулярная линза увеличивает объект (2) на рисунке 1, соответствующее разрешение по размеру в конечном виртуальном изображении (3) не может быть лучше 0,2 микрона.
Райф нашёл способ преодолеть дифракционное ограничение Фраунгофера, что позволило ему создать микроскоп, с помощью которого можно было видеть вирусы. Райф применил принцип обратимости новым и необычным способом. Принцип обратимости гласит: если отражённый или преломлённый луч направить в противоположную сторону, он пройдёт тот же путь, что и раньше. Этот принцип имеет не только чисто геометрическую основу, но и может быть выведен из соответствующего механического принципа, применимого к волновому движению. Другими словами, явление дифракции (волновое явление) также устраняется путём изменения направления светового луча.
На рисунке 4 мы видим двояковогнутую линзу, которая сформировала изображение I точечного источника света О.
Как видно, изображение I не является точкой, а имеет форму концентрических светлых и тёмных зон, как на рисунке 3. Теперь, согласно принципу обратимости, если изображение дифракционной картины I с рисунка 4 направить обратно через двояковогнутую линзу, то сформируется исходное точечное изображение О, а не обычное изображение дифракционной картины от точечного источника света.
Обратите внимание, что изображение на рисунке 4 формируется в пространстве, а не на экране. Изображение дифракционной картины, которое возвращается через линзу, по сути, является обратным во времени световым «изображением». Это не свет, отражённый от изображения, сформированного на материальном экране.
Теперь рассмотрим рисунок 5, на котором показан объектив с составной линзой, используемый в мощных оптических микроскопах для формирования изображения I точечного источника света О.
Как и в случае с объективом с одной линзой, точечное изображение не сформируется. Вместо этого сформируется дифракционная картина Фраунгофера, как показано на рисунке. Для простоты показана дифракционная картина Фраунгофера для одной линзы, однако реальная картина будет представлять собой совокупность отдельных дифракционных картин Фраунгофера для трёх линз в системе. Реальная картина будет качественно такой же, как на рисунке (яркий центральный световой диск, известный как диск Эйри, окружённый более тёмными и светлыми концентрическими зонами). И, как и прежде, если бы дифракционная картина (изображение) была направлена обратно через систему объективов, то сформировалось бы изображение световой точки, а не дифракционная картина. Райф, по-видимому, понял, что он может устранить явление дифракции Фраунгофера и добиться большого увеличения, используя окуляр, точно такой же, как и объектив, но установленный в направлении, противоположном объективу (задом наперёд), и одновременно вставляя оптически симметричный световой луч между окуляром и объективом (рисунок 6A).
Рисунки 6B и 6 C качественно иллюстрируют траектории световых лучей на сферически вогнутых поверхностях оптически симметричной сборки, расширяющей луч, показанной на рисунке 6A.
Рисунок 6D иллюстрирует, как оптически симметричная сборка, расширяющая луч, отбрасывает слишком расходящиеся световые лучи, когда они образуют слишком малый угол с тремя нормалями к стенке призмы.
На рисунке 6Е представлена подробная схема трассировки лучей для двухступенчатой версии четырёхступенчатой оптически симметричной оптической системы, расширяющей световой пучок, показанной на рисунке 6A. Каждая пара противоположных сферически вогнутых поверхностей считается одной ступенью. На этом рисунке показано, как световой пучок от объектива расширяется таким образом, что только световые лучи, расположенные очень близко к оптической оси входящего сходящегося пучка, достигают входа в окуляр. Обратите внимание, что непосредственно перед тем, как сходящийся луч от системы объективных линз достигает точки фокуса, формируя изображение, он сталкивается с границей раздела между материалом призмы и воздухом на сферически вогнутой поверхности призмы. Этот сходящийся луч проходит через оптическую ось сферически вогнутой поверхности призмы.
При пересечении сферически вогнутой границы раздела сходящийся луч преобразуется в расходящийся (расширяющийся) луч вокруг своей центральной оси. По мере того как этот расходящийся луч проходит через каждую дополнительную сферически вогнутую поверхность, центральная часть луча снова расширяется вокруг своего осевого центра. Именно эта значительно расширенная («увеличенная») часть луча фокусируется в изображение с помощью окуляра. Поскольку каждая сферически вогнутая поверхность призмы сопряжена с идентичной сферически вогнутой поверхностью призмы, ориентированной в противоположном направлении, практически все явления дифракции Фраунгофера, возникающие на одной вогнутой поверхности призмы, устраняются соседней поверхностью, если рассматривать влияние только на световые лучи (волны), находящиеся очень близко к оптической оси. Разумеется, оптические оси соседних вогнутых поверхностей призм должны максимально совпадать друг с другом. Расширенный световой луч, выходящий из плоской поверхности последней призмы и попадающий в систему линз окуляра, имеет тот же угол расхождения (и обратный угол схождения), что и световой луч, выходящий из системы линз объектива, при условии, что расстояние между поверхностью призмы и первой поверхностью линзы окуляра выбрано правильно. Когда расширенная часть исходного луча фокусируется в изображение, она попрежнему содержит дифракционную картину Фраунгофера, полученную при прохождении через систему линз объектива. Однако окуляр, который идентичен (согласован) системе линз объектива, но используется в противоположной ориентации, создаёт дифракционную картину Фраунгофера, которая практически полностью нивелирует исходную дифракционную картину Фраунгофера, создаваемую системой линз объектива.
Рисунок 7 представляет собой схематическое изображение типичного микроскопа Райфа, подобного тем, что были сконструированы Райфом. Сейчас мы обсудим оптику этого микроскопа, а затем рассмотрим его современную версию, которую можно собрать и сейчас. Секция светового конденсора микроскопа состоит из элементов (1) –(4). Они концентрируют свет от ртутной дуговой лампы (2) в интенсивный сходящийся луч света, который направляется на линзу (5). Линза (5) превращает интенсивный сходящийся луч света в тонкий параллельный луч в форме карандаша, который направляется в центр призмы Рисли (6). Призма Рисли, состоящая из двух вращающихся в противоположных направлениях тонких призм, разделяет интенсивный луч света на веерообразный спектр. Если угол падения светового пучка на плоскость призмы Рисли фиксирован, то угловая ширина и ориентация спектра определяются относительным углом поворота между двумя призмами (эффективным вершинным углом призмы Рисли). Небольшая часть длин волн этого спектра попадает в круглое отверстие диафрагмы переменного диаметра (7). Настройка призмы Рисли определяет точную длину волны света, проходящего через центральную линию диафрагмы, а диаметр диафрагменного отверстия определяет разброс значений длины волны, проходящей через диафрагму, с выбранной центральной длиной волны. Линза (8) фокусирует выбранную длину волны и связанное с ней распределение длин волн в интенсивное световое пятно непосредственно под образцом, расположенным на предметном стекле из кварца на подставке микроскопа (9). (С таким же успехом можно было бы использовать настройку темного поля.) Объектив микроскопа (10) работает как обычный объектив микроскопа. Однако обратите внимание, что в оригинальных микроскопах Райфа различные линзы, из которых состоит объектив, не имеют цветовой коррекции. Об этом будет сказано далее в тексте. Преломлённый свет, выходящий из объектива (10), имеет очень малый угол расхождения (примерно один градус или меньше). Когда этот преломлённый свет попадает в призматическую систему (11), его угол схождения значительно уменьшается из-за изменения показателя преломления на плоской грани призмы. Это позволяет сходящемуся лучу проходить внутри первой призмы без существенного схождения. Когда луч света от объектива проходит через систему призм, он расширяется в диаметре вокруг главного центрального луча. Расходящийся и расширяющийся луч света, выходящий из плоской поверхности последней призмы, попадает в соответствующий окуляр (12), где практически полностью устраняется явление дифракции Фраунгофера, возникающее в системе объективов, и формируется окончательное изображение.
До сих пор мы рассматривали только явление дифракции как основной фактор, ограничивающий разрешающую способность и, следовательно, определяющий полезное увеличение объекта. Существует ещё одна проблема — хроматическая аберрация (рисунок 8), которую Райфу пришлось преодолеть, чтобы добиться необходимого пространственного разрешения для наблюдения вирусов.
Рисунки 8 A, B и C иллюстрируют проблему, с которой сталкиваются обычные линзы в стандартных мощных оптических микроскопах при формировании чёткого изображения многоцветного объекта. На рисунке 8 A показано, как меняется показатель преломления в зависимости от цвета (длины волны) и, следовательно, как меняется точка фокуса в зависимости от цвета. Практические последствия изменения показателя преломления в зависимости от цвета показаны на рисунке 8 °C. Один и тот же объект, если смотреть на него через линзы разного цвета, будет иметь разное расположение изображения и разное увеличение. На рисунке 8 B показан склеенный двояковогнутый объектив, состоящий из положительной двояковыпуклой линзы из крон-стекла и отрицательной двояковогнуто-плоской линзы из флинт-стекла. Мощность равновыпуклой линзы больше по величине, чем величина отрицательной мощности линзы с вогнутой плоскостью, и, следовательно, комбинация имеет общую положительную мощность. Возможность коррекции цвета с помощью этой комбинации обусловлена тем фактом, что дисперсии, получаемые из различных видов стекла, непропорциональны по производимым ими отклонениям.
На рисунках 9 A, B и C показаны три различных объектива микроскопа стандартного типа, в которых используется описанная выше цветокоррекция. Однако Райф решил не использовать этот метод цветокоррекции в системах объективов и окуляров своих микроскопов (рисунок 7). Вместо этого он использовал в системах объективов и окуляров только линзы из плавленого кварца (рисунки 9 D и 9 E). Ему удалось обойтись без цветокоррекции, потому что, когда он нашёл решение другой распространённой проблемы при микробиологических наблюдениях с помощью микроскопа, он понял, что в целом цветокоррекция ему не нужна.
Другая распространённая проблема заключается в том, чтобы сделать образец (бактерии или вирусы) хорошо видимым. Обычно для окрашивания бактерий (которые после окрашивания становятся мёртвыми) используются красители, чтобы их можно было хорошо рассмотреть и идентифицировать. Когда речь идёт о вирусах, этот метод, как правило, неприменим из-за размера красящего пигмента в некоторых красителях и по другим причинам. Райф обнаружил, что при изучении любой бактерии или вируса с помощью микроскопа он всегда мог найти по крайней мере одну узкую полосу длин волн света, которая заставляла бактерию или вирус светиться или флуоресцировать. Кроме того, люминесцентный и/или флуоресцентный цвет (узкая полоса длин волн) бактерии или вируса был уникальным, как и длина волны, вызывающая флуоресценцию. Другими словами, Райф нашёл способ, с помощью которого образец сам излучал свет одного цвета. Поэтому коррекция цвета не требовалась. Однако были случаи, когда микробы люминесцировали и/или флуоресцировали двумя разными цветами, но один из них обычно был намного ярче другого. При фокусировке изображения с использованием более яркого излучения с большей длиной волны вокруг изображения объекта будет виден тусклый ореол из-за расфокусировки тусклого люминесцентного и/или флуоресцентного излучения с большей длиной волны. Есть ещё две очевидные причины, по которым Райф не использовал объективы с коррекцией цвета. Недостатком микроскопов являются дополнительные потери света на границах раздела различных материалов, а также его стремление «видеть» как визуально, так и с помощью фотографии, дальше, в ультрафиолетовом диапазоне спектра, что позволяла система линз из чистого кварца.
На рисунке 10 изображена модернизированная версия микроскопа Райфа. Такой микроскоп может быть создан в любом современном университете и будет стоить гораздо дешевле электронного микроскопа. Преимущества микроскопа Райфа перед электронным микроскопом:
- Гораздо меньше времени на подготовку и настройку образца.
- Образец (бактерия или вирус) рассматривается в естественной среде, без искажений/ разрушений, вызванных процедурами подготовки образца и/или процессами наблюдения.
- Благодаря большому количеству доступных в настоящее время флуоресцентных молекулярных меток, специфичных для белков и соединений, с помощью микроскопа Райфа в сочетании со сверхбыстрыми и синхронизированными перестраиваемыми лазерными источниками с модуляцией добротности можно получать замедленные изображения или видео множества клеточных процессов с высоким разрешением (менее 50 ангстрем). (Здесь предполагается использование объектива с коррекцией цвета.)
- Микроскоп Райфа быстро и однозначно продемонстрировал бы, что вопреки общепринятому в настоящее время мономорфному представлению о микробах, многие из них на самом деле являются плеоморфными (полиморфными), когда этого требуют условия окружающей среды.
- Эксплуатация и обслуживание обходятся гораздо дешевле.
- Многие заболевания, причины которых в настоящее время неизвестны, можно было бы быстро и однозначно отнести к патогенным. Именно это и сделал Райф в 1920-х и 1930-х годах.
- При непосредственном наблюдении за возбудителем заболевания с помощью микроскопа Райфа можно определить резонансные ультразвуковые частоты, которые уничтожают именно этот возбудитель.
Каковы будут фактические пределы разрешения и, следовательно, эффективного полезного увеличения для современного микроскопа типа Райфа, неизвестно. Однако есть все основания полагать, что он может легко превзойти лучшие из доступных на сегодняшний день электронных микроскопов.